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    冬虫夏草原生质体形成和再生的初步研究 张华1

    ,钱秀萍2 3

    ,袁萍3

    (11上海师范大学生命环境学院 ,上海 200234 ;21上海交通大学药学院 ,上海 200030 ;31上海新康制药厂 ,上海 200234)

    摘要:研究冬虫夏草菌丝体的菌龄、酶种类、酶解温度、酶解时间、 pH、稳渗剂和几种再生培养基对原生质体形成和再生的影

    响。最佳条件为:生长6d的菌丝体 ,组合酶(1 %蜗牛酶 + 1 %纤维素酶) ,酶解温度36℃,酶解时间2. 5h ,pH6. 4 ,稳渗剂0. 4M甘露

    醇溶液 ,RM3再生培养基。在此条件下原生质体的形成为2. 04× 10

    9

    个P ml ,再生率为0. 091 %。

    关键词:冬虫夏草;原生质体;形成;再生

    中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1004 - 311X(2004) 02 - 0049 - 02

    收稿日期:2003 - 09 - 03 ;修回日期:2003 - 11 - 04

    作者简介:张华,硕士生; 3 通讯作者:钱秀萍,博士,副教授,研究方

    向:微生物药物学。

    冬虫夏草 Cordyceps sinesis (Berk. ) Sacc.为麦角菌科真菌 ,是真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫后形成的子座和菌核的复合

    体[1 ]。虫草味甘性平 ,主要功效可保肺肾 ,补精髓 ,化痰止劳

    咳[2 ]。现代药理实验证明其具有扩张支气管、控制心跳、镇静

    催眠、雌激素样等作用 ,此外 ,虫草还具有抗癌活性和抑制病

    菌、提高机体免疫功能等功效[3 ]。但虫草的野生资源有限 ,而

    虫草无性型发酵菌丝体的主要有效成份含量与野生型的有效

    成分含量大致相同 ,甚至大于野生虫草[4 ]

    ,因此 ,人工发酵的

    菌丝体有可能代替天然的虫草。在微生物育种研究中 ,国内

    外学者进行了大量的研究 ,试图通过细胞原生质体融合[5 ,6 ]

    、转化[7 ]

    来实现基因重组[8 ]

    ,以及通过诱变技术[9 ,10 ]

    来获得高产

    菌株和多功能菌株。作为一个优良的实验系统 ,原生质体已

    经在微生物及相关的不少领域得到应用[11 ]。为使宝贵的虫草

    资源研究开发最终实现产业化 ,本实验对冬虫夏草原生质体

    的制备和再生条件进行了研究 ,为进一步的诱变育种、原生质

    体融合及分子调控方面的研究创造条件。

    1 材料与方法 1. 1 菌株

    冬虫夏草( Cordyceps sinesis (Berk. ) Sacc. ) Cs - 0111 ,上海市

    农科院。

    1. 2 主要试剂

    纤维素酶 Cellulase (中国医药集团上海化学试剂公司) ;蜗

    牛酶 Snailase (北京百泰生化技术公司) ;溶菌酶Lysozyme (上海

    伯奥生物科技有限公司) 。

    1. 3 仪器

    显微镜 EMED(Leica Microscope Ltd. Shanghai) ;THZ- C恒温

    振荡培养箱(江苏太仓实验设备厂) ;752 紫外光栅分光光度计

    (上海第三分析仪器厂) 。

    1. 4 培养基及培养条件

    1. 4. 1 生长培养基

    WM液体培养基:麦麸30g(煮汁) ,葡萄糖 20g ,KH2 PO4 3g ,MgSO4· 7H2O 1. 5g ,加水至 1000ml WM固体培养基:每 1000ml

    的 WM培养基中加琼脂18～20g PDA培养基。

    1. 4. 2 再生培养基

    RM1培养基[12 ]

    :土豆 100g ,酵母粉 3g ,蛋白胨 5g ,葡萄糖

    20g ,KH2 PO4 2g , (NH4 ) 2 SO4 1g ,MgSO4· 7H2O 2g ,VB1 10mg ,琼脂

    18g ,0. 5mol甘露醇 ,水加至1000ml。

    RM2培养基:PDA中加入0. 5M的甘露醇。

    RM3培养基[13 ]

    :麦芽糖 10g ,葡萄糖 4g ,酵母粉 4g ,甘露醇

    0. 5mol ,pH 6. 2 ,琼脂 18g ,水加至1000ml。

    RM4培养基:蔗糖 5g , KH2 PO4 0. 15g ,MgSO4 0. 05g ,Asn 0.

    2g ,VB1、 VB6各0. 01g ,pH 6. 2 ,甘露醇 0. 5mol ,琼脂 18g ,水加至

    1000ml。

    1. 5 原生质体制备

    将 Cs - 0111斜面菌种接种于 PDA培养基平板上培养 7d ,用打孔器(Ф≈0. 8cm)在平板表面打孔 ,挑取一块菌块 ,捣碎后

    转接至100ml WM液体培养基中 ,28℃,150rP min振荡培养。

    用100目孔径的铜网过滤收集菌丝体 ,先后用蒸馏水和

    0. 5M甘露醇溶液洗涤 ,最后用滤纸吸干多余水分。按 1 :10

    (菌丝体湿重 g :酶液体积 ml)的比例加入酶液酶解 ,以 0. 5cm

    厚的脱脂棉过滤菌丝片段 ,滤液用0. 5M甘露醇溶液稀释后在

    血球计数板上计数 ......